Phospho-ALK (Tyr1278) Antibody (Rabbit mAb) [N16F10]
目录号: F1503
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: KARPAS-299, Lane 2: KARPAS-299 (phosphatase treated membrane)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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176 kDa
80 kDa (NPM-ALK); 220 kDa (ALK)
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | SUP-M2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-ALK (Tyr1278) Antibody (Rabbit mAb) [N16F10] 仅识别 Tyr1278 处磷酸化的内源性 ALK 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UM73 |
| 克隆号 |
|---|
| N16F10 |
| 别名 |
|---|
| ALK; ALK receptor tyrosine kinase; ALK tyrosine kinase receptor; CD246; CD246 antigen; mutant anaplastic lymphoma kinase; NBLST3 |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化ALK（Tyr1278）是指受体酪氨酸激酶ALK在其激活环内的活化形式，这种状态是全长ALK和ALK融合蛋白在多种肿瘤中发挥致癌信号传导的基础。ALK属于胰岛素受体超家族，包含一个胞外配体结合区、一个跨膜螺旋和一个胞内激酶结构域。该激酶结构域的激活环包含Tyr1278以及邻近的酪氨酸残基。当配体结合或致癌二聚化使ALK分子彼此靠近时，这些酪氨酸残基会发生自身磷酸化，从而使激酶从低活性状态转变为高活性状态，并能够有效地磷酸化底物。 Tyr1278被极性或带电残基取代后，产生的ALK变体具有组成型激酶激活、增强的自身磷酸化以及配体非依赖性转化活性，表明该位点的磷酸化或突变稳定了激活环的活性构象，并消除了催化裂隙的自身抑制限制。激活的Tyr1278磷酸化ALK通过磷酸化衔接蛋白和对接蛋白（如IRS 1、Shc、PLCγ以及其他通过磷酸化蛋白质组学分析鉴定的底物）来触发多个下游级联反应，包括PI3K-AKT、RAS-ERK、JAK-STAT和PLCγ通路。这些通路共同驱动ALK阳性肿瘤细胞的增殖、存活、迁移和转化。致癌性ALK的激活可通过染色体易位发生，使ALK激酶结构域与具有寡聚化能力的伴侣蛋白（例如间变性大细胞淋巴瘤中的NPM1和非小细胞肺癌中的EML4）融合；也可通过激活点突变和扩增在神经母细胞瘤中发生；此外，ALK的激活还可通过异常过表达在其他多种恶性肿瘤中发生。在每种情况下，激活环（包括Tyr1278）的组成型磷酸化都是致癌性激酶状态的生化标志。磷酸化特异性抗体仅识别Tyr1278位点磷酸化的ALK（该位点相当于NPM ALK中的Tyr338），可检测ALK驱动的癌细胞系和原发肿瘤中的这种修饰，并直接反映ALK的催化活性，从而补充了用于鉴定ALK重排或突变的基因检测方法。 |
| 参考文献 |
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