Phospho-DDR1/DDR2 (Tyr796/740) Antibody (Mouse mAb) [M16G11]
目录号: F7534
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HEK293 (hDDR2 transfected), Lane 2: HEK293 (hDDR2 transfected; Calyculin A, 100 nM, 10 min)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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97 kDa
120-130 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | MCF-7 cells; MCF-7 PAPP-A cells |
|---|---|
| 阴性对照 | MCF-7 PAPP-A/E483Q cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-DDR1/DDR2 (Tyr796/740) Antibody (Mouse mAb) [M16G11] 仅识别 Tyr796/740 处磷酸化的内源性 DDR1/DDR2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q16832, Q08345 |
| 克隆号 |
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| M16G11 |
| 别名 |
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| 6030432F18;AI323681;CAK;CD167;CD167a;DDR;DDR1;Drd1;EDDR1;HGK2;MCK10;Mpk6;NEP;NTRK4;PTK3;PTK3A;PTK3D;RTK6;TRKE |
| 背景 |
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| 磷酸化DDR1/DDR2 (Tyr796/740) 指的是胶原受体DDR1和DDR2的激活形式。DDR1和DDR2是两种盘状结构域受体酪氨酸激酶，它们整合细胞外基质信号和细胞内信号，从而控制细胞黏附、迁移和基质重塑。DDR1包含一个盘状结构域样胶原结合结构域、一个跨膜区段、一个近膜区和一个胞内激酶结构域，其激活环包含Tyr796；胶原蛋白结合会诱导受体在多个酪氨酸残基上发生缓慢但持续的自身磷酸化，而针对磷酸化Tyr796的特异性抗体只能检测到处于这种配体激活状态的DDR1，这标志着能够传递下游信号的有效激酶构象。 DDR2 具有相似的结构域布局，同样被纤维状胶原激活，但其激活环内的 Tyr740 是一个调控位点，不仅在受体自身磷酸化过程中被磷酸化，还能被 Src 家族激酶直接磷酸化，从而成为 DDR2 信号输出的关键调控点。DDR2 的生化分析表明，Src 靶向激活环上的三个残基（Tyr736、Tyr740 和 Tyr741）；Tyr740 的磷酸化会刺激 DDR2 分子内其他胞质酪氨酸残基的自身磷酸化，这些酪氨酸残基随后作为接头蛋白 Shc 的结合位点，并组装成 DDR2-Shc 信号复合物，从而将胶原结合与 Ras-MAPK 和其他 Shc 依赖性通路连接起来。 Tyr740突变为苯丙氨酸可解除激活环内的抑制性约束，产生一种不依赖于胶原蛋白的自磷酸化和组成型信号传导的受体，表明未磷酸化的Tyr740侧链抑制激酶活性，而其修饰或取代可使DDR2向活性构象转变。因此，在DDR1和DDR2中，Tyr796和Tyr740的磷酸化决定了胶原蛋白和Src响应性激活环的状态，这些状态控制着受体的自磷酸化、衔接蛋白的募集以及信号传导至调控细胞-基质黏附、运动和组织重塑的信号通路。特异性定量裂解液中磷酸化DDR1（Tyr796）和磷酸化DDR2（Tyr740）的检测方法，可直接提供胶原蛋白与盘状蛋白受体结合以及Src依赖性DDR2活性在生理和病理条件下调控的生化读数。 |
| 参考文献 |
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