Phospho-eIF4E (Ser209) Antibody [G23F17]
目录号: F5399
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (Anisomycin, 25 μg/mL, 30 min), Lane 3: Hela, Lane 4: Hela (Anisomycin, 25 μg/mL, 30 min)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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25 kDa
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| 阳性对照 | NBT-II cells; RBL-1 cells; Rat2 cells; A-10 cells; C6 cells; 293T cells (anisomycin, 25 μg/mL, 30 min); HeLa cells (anisomycin, 25 μg/mL, 30 min) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-eIF4E (Ser209) Antibody [G23F17] 仅识别 Ser209 处磷酸化的内源性 eIF4E 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 染色体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P06730 |
| 克隆号 |
|---|
| G23F17 |
| 别名 |
|---|
| Eukaryotic translation initiation factor 4E; eIF-4E; EIF4E |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化 eIF4E (Ser209) 标记了 mRNA 5′ 端帽结合起始因子 4E (eIF4E) 上的关键调控位点。eIF4E 是帽依赖性翻译调控的核心节点，它与支架蛋白 eIF4G 和 RNA 解旋酶 eIF4A 共同组成 eIF4F 复合物。eIF4E 识别 5′ 端加帽 mRNA 的 7-甲基鸟苷帽，其与 eIF4G 的相互作用可稳定 eIF4F 复合物并促进核糖体募集。MAPK 激活的激酶 Mnk1 和 Mnk2 对 Ser209 位点的翻译后修饰，可在不破坏 eIF4E 与 eIF4G 结合本身的情况下，微调 eIF4E 的亲和力和功能输出。 ERK 和 p38 MAPK 级联的激活可动员 Mnk1/2 磷酸化 eIF4E C 端结构域内的 Ser209 位点，这一事件增强了编码生长和存活相关蛋白（例如细胞周期蛋白和抗凋亡因子）的 mRNA 子集的翻译，从而将细胞外信号与恶性肿瘤相关蛋白的选择性产生联系起来。Ser209 磷酸化通过促进恢复期蛋白合成和上调 Mcl-1 等促存活因子，增强细胞对氧化应激、营养应激和细胞毒性应激的抵抗力。在肿瘤发生过程中，持续的 eIF4E Ser209 磷酸化驱动肿瘤增殖、转移和治疗耐药性，而阻断 Mnk 依赖的 eIF4E 磷酸化则抑制 eIF4E 驱动的致癌翻译和肿瘤生长。 |
| 参考文献 |
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