Phospho-HER4/ErbB4 (Tyr1284)/EGFR (Tyr1173) Antibody (Rabbit mAb) [D10B7]
目录号: F0397
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: COS (ERBB4 KD), Lane 2: COS
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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147 kDa
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| 阳性对照 | COS-7 ErbB4 KD cells; A431 + EGF cells; MCF7 + Heregulin (HRG) cells |
|---|---|
| 阴性对照 | COS-7 + EGFR cells; MCF7 (unstimulated) cells; CHO/IR/IRS-1 cells; NIH/3T3 + PDGFR cells; Sf9 cells; MEFs + CSF-1R cells; NR6 cells; COS-7 + FGFR1 cells; Tie2 (cytoplasmic) cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-HER4/ErbB4 (Tyr1284)/EGFR (Tyr1173) Antibody (Rabbit mAb) [D10B7] 仅识别 Tyr1284 处磷酸化的内源性 HER4/ErbB4 和 Tyr1173 处磷酸化的内源性 EGFR 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q15303 |
| 克隆号 |
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| D10B7 |
| 别名 |
|---|
| 4ICD; ALS19; E4ICD; erb-b2 receptor tyrosine kinase 4; ERBB4; ERBB4 intracellular domain; HER4; human epidermal growth factor receptor 4; MGC138404; p180erbB4; s80HER4 |
| 背景 |
|---|
| HER4/ErbB4 的 Tyr1284 位点磷酸化和 EGFR 的 Tyr1173 位点磷酸化是 HER/ErbB 家族两种受体酪氨酸激酶胞质尾部的激活依赖性表位，它们标志着配体诱导的信号状态，这些状态将细胞外生长因子信号整合到细胞内级联反应中，从而控制细胞增殖、存活和分化。这两个受体都具有模块化结构，包含一个胞外配体结合域、一个跨膜区段、一个胞内酪氨酸激酶结构域和一个 C 端尾部。C 端尾部含有多个酪氨酸残基，这些酪氨酸残基在受体二聚化时发生自磷酸化。EGFR 中的 Tyr1173 和 ErbB4 中的 Tyr1284 位于该尾部，是下游效应分子停靠的关键位点。 EGFR与EGF家族配体结合后，由单体转变为活性同源或异源二聚体（例如与HER2结合），从而激活其内在激酶活性，并导致多个C端酪氨酸残基（包括Tyr1173）的自身磷酸化；磷酸化的尾部募集含有SH2或PTB结构域的衔接蛋白，例如Shc和Grb2，进而启动包括Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-AKT、PLCγ-PKC和STAT信号通路在内的主要下游信号通路，这些通路共同调控细胞迁移、黏附、增殖和存活。Tyr1173的磷酸化作为Shc和其他衔接蛋白的重要结合位点，协调受体处信号复合物的组装，并支持促有丝分裂信号的传递；而内吞作用和磷酸酶的去磷酸化则提供反馈，减弱信号传导并重置受体的反应性。 HER4/ErbB4 可被神经调节蛋白和多种 EGF 家族配体激活，并与其他 ErbB 成员形成同源二聚体和异源二聚体。配体结合会触发多个酪氨酸残基（包括 Tyr1284）的自身磷酸化，这些酪氨酸残基可作为支架蛋白和效应分子的结合位点，将受体与 MAPK 和 PI3K-AKT 通路连接起来，进而参与肌动蛋白细胞骨架的重组和细胞迁移。含有与 PI3K 募集相容的胞质序列的特定 ErbB4 亚型利用磷酸化的尾部酪氨酸残基与 PI3K 的 p85 调节亚基结合，从而促进 AKT 激活并抑制细胞凋亡。而缺乏这些结构基序或近膜加工方式不同的亚型则与 PI3K 的偶联能力降低，转而倾向于其他信号通路。这表明尾部磷酸化酪氨酸残基（包括 Tyr1284）的模式如何影响受体特异性通路的激活。 ErbB4的蛋白水解加工可释放胞内结构域，这些结构域转位至细胞核或线粒体，与STAT5A等转录因子在CSN2等启动子上相互作用，从而调控基因表达或激活影响细胞凋亡的线粒体通路。全长受体胞质尾部残基的磷酸化先于并调节这些依赖于蛋白水解的功能。在发育和生理过程中，ErbB4通过其磷酸酪氨酸位点进行信号传导，对于心肌分化、中枢神经系统发育以及乳腺分化和泌乳至关重要；而EGFR通过Tyr1173和其他位点进行信号传导，则有助于上皮细胞生长、再生和正常组织稳态的维持。在疾病环境中，EGFR Tyr1173 的异常激活和持续磷酸化与致癌信号传导和癌症进展有关，驱动过度的促有丝分裂和生存通路活性，而 ErbB4 表达或磷酸化模式的改变与多种癌和神经精神疾病相关，其中配体反应性、二聚化伙伴和尾部磷酸酪氨酸组合的变化可以重编程转录输出和细胞命运决定。 |
| 参考文献 |
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