Phospho-Histone H2A (Ser129) Antibody [A4N9]
目录号: F3871
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Saccharomyces cerevisiae (0.2% Methyl methanesulfonate, 1 h), Lane 2: Saccharomyces cerevisiae
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议曝光 150s 以上。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：20%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
建议曝光 150s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, ChIP, ELISA |
| 反应性 |
|---|
| Human, Saccharomyces cerevisiae |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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14 kDa
14 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Saccharomyces cerevisiae cells; Saccharomyces cerevisiae (Methyl methanesulfonate, 0.2%, 1 h) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Histone H2A (Ser129) Antibody [A4N9] 仅识别 Ser129 处磷酸化的内源性 Histone H2A 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 染色体，核小体核心，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P04912 |
| 克隆号 |
|---|
| A4N9 |
| 别名 |
|---|
| H2A2; YBL003C; YBL0103; HTA2; Histone H2A.2 |
| 背景 |
|---|
| Ser129位点的磷酸化组蛋白H2A (H2A S129ph) 是一种保守的、由DNA损伤诱导的组蛋白修饰，在基于染色质的信号级联中发挥着核心作用，协调双链断裂 (DSB) 修复和基因组完整性，尤其是在酵母和哺乳动物系统中，它作为更广泛的H2A.X变体组蛋白家族的一部分发挥作用。该修饰发生在C端SQ基序上，该基序在DNA断裂后被磷脂酰肌醇3激酶相关激酶（如ATM和ATR）磷酸化，产生一个局部磷酸化表位，该表位扩散到损伤位点两侧数千碱基对的染色质区域，从而作为下游修复因子的成核平台。 H2A S129ph 直接募集染色质修饰复合物，例如 NuA4 组蛋白乙酰转移酶和 Ino80/Swr1 型 ATP 依赖性重塑复合物。这些复合物通过识别磷酸化尾部的特定亚基锚定，从而促进附近核小体的乙酰化和重构，增强受损 DNA 对修复酶的可及性。这种磷酸化 H2A 依赖性的募集作用，通过促进 DSB 检测和处理因子在断裂位点的组装和保留，支持高效的同源重组和非同源末端连接，同时还与细胞周期检查点相互作用，延缓细胞周期进程直至修复完成。 H2A S129ph 被广泛用作 DSB 生成和修复效率的灵敏、高分辨率读数，其磷酸化或识别机制的失调会导致修复反应缺陷、基因组不稳定性增加以及对基因毒性药物的超敏反应，因此，在 DNA 修复缺陷和易患癌症的背景下，H2A S129ph 依赖的信号传导最终会失调。 |
| 参考文献 |
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