Phospho-MAPKAPK-2 (Thr334) Antibody (Rabbit mAb) [J17A19]
目录号: F0249
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa (serum-starved overnight), Lane 2: HeLa (serum-starved overnight; PMA, 50 nM, 30 min; UV- 30 min)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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46 kDa
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| 阳性对照 | HeLa cells (UV+TPA-treated); COS cells (UV+TPA-treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa cells; COS cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-MAPKAPK-2 (Thr334) Antibody (Rabbit mAb) [J17A19] 仅识别 Thr334 处磷酸化的内源性 MAPKAPK-2 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P49137 |
| 克隆号 |
|---|
| J17A19 |
| 别名 |
|---|
| MAP kinase-activated protein kinase 2; MAPK activated protein kinase 2; MAPK-activated protein kinase 2; MAPK2; MAPKAP kinase 2; MAPKAP-K2; MAPKAPK-2; MAPKAPK2; MK-2; MK2 |
| 背景 |
|---|
| MAPKAPK-2，也称为MK2，属于CAMK丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是p38α MAPK的直接下游底物，在受到刺激前与p38α形成生理复合物，该复合物位于静息细胞的细胞核内。MK2的N端富含脯氨酸，连接着一个催化激酶结构域；其后是一个C端调节结构域，该结构域包含一个双元核定位信号和一个核输出信号。未磷酸化的MK2晶体结构显示，该C端区域折叠成螺旋-转角-螺旋结构，并延伸出一条链，以自身抑制的构象与激酶结构域紧密堆积。激活后，p38α在三个位点磷酸化MK2，这三个位点是MK2发挥完全激酶活性所必需的：激活环内的苏氨酸222、丝氨酸272以及位于激酶结构域和C端调节结构域之间的苏氨酸334。 p38α-MK2异二聚体的结构分析表明，这两个激酶以头对头的方式结合，它们的活性位点位于复合物的同一侧。在未磷酸化状态下，含有核输出信号的MK2片段直接阻断了p38α活性位点的接近。Thr334位点的磷酸化并非简单地完成激酶的激活，而是一种构象开关：它削弱或中断了C端调控结构域与催化结构域的紧密堆积，从而暴露了先前埋藏在激酶结构域C叶表面的核输出信号。该暴露的输出信号与对勒托霉素B敏感的核输出受体结合，将MK2及其结合的p38α一起从细胞核转运到细胞质中。这种依赖于Thr334的核输出过程需要磷酸化本身，但不需要MK2的催化活性。这意味着磷酸化作用如同一个独立于底物周转的结构开关。由于p38α自身缺乏核输出信号，它完全依赖于与磷酸化MK2形成复合物才能转位至细胞质。一旦输出，细胞质中具有活性的MK2会磷酸化下游效应分子，包括HSP27、三四脯氨酸蛋白以及其他在炎症反应期间调节细胞骨架动力学和mRNA稳定性的靶点。通过这一单一的Thr334控制的重定位事件，核内p38的激活与特定的细胞质磷酸化程序相偶联。 |
| 参考文献 |
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