Phospho-MBP (Thr98) Antibody [A3B1]
目录号: F4399
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| vertebrates |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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33 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-MBP (Thr98) Antibody [A3B1] 仅识别 Thr98 处磷酸化的内源性 MBP 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
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| P02686 |
| 克隆号 |
|---|
| A3B1 |
| 别名 |
|---|
| Myelin basic protein; MBP; Myelin A1 protein; Myelin membrane encephalitogenic protein; MBP |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化髓鞘碱性蛋白（Phospho-MBP）是指中枢神经系统髓鞘内经翻译后修饰的髓鞘碱性蛋白亚型。其中，保守的苏氨酸残基（如Thr95和Thr125）上的MAPK介导的磷酸化动态调节着髓鞘多层结构的稳定性以及与细胞骨架的相互作用。髓鞘碱性蛋白组织着两亲性α螺旋片段和富含脯氨酸的聚脯氨酸II螺旋两侧的固有无序区域，这些区域通过与磷脂头部基团和肌动蛋白微丝的多价阳离子相互作用，使相邻的胞质层紧密排列。磷酸化引入的负电荷会通过静电作用破坏髓鞘碱性蛋白与脂质的粘附，从而松散髓鞘的紧密性，同时改变中心分子开关区域。在该区域，Thr92/Thr95的磷酸化会阻碍α螺旋的折叠稳定性，并通过改变富含脯氨酸结构域中的排斥作用，降低热扰动后的可逆性。这种修饰减弱了MBP-肌动蛋白的聚合和束集能力，同时显著减少了带负电荷的双层膜上肌动蛋白-MBP-脂质三元复合物的形成。MAPK在两个位点的连续作用进一步加剧了抑制作用，其效果远超单纯的净电荷减少。高频神经元刺激通过MAPK激活触发肺泡MBP的过度磷酸化，从而传播动作电位。而河豚毒素阻断则阻止了这种受调控的松解，这对于突触重塑过程中髓鞘的可塑性至关重要。所有四种主要的MBP电荷异构体均表现出协调的去磷酸化反应，反映了同工型非特异性通路调控。磷酸化MBP在CNS发育和活动依赖性髓鞘形成过程中调节传导速度适应和少突胶质细胞突起动力学。 |
| 参考文献 |
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