Phospho-Met (Tyr1349) Antibody [D24L22]

目录号: F4617

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: H-4-II-E, Lane 2: H-4-II-E (HGF, 50ng/mL, 5min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。

使用信息

稀释比例
WB1:1000

抗体应用
WB

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
145 kDa

阳性对照	H4IIE cells (HGF-treated)
阴性对照	H4IIE cells

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-Met (Tyr1349) Antibody [D24L22] 仅识别 Tyr1349 处磷酸化的内源性 Met 蛋白水平。

蛋白定位
内膜系统，细胞外环境

Uniprot ID
P08581

克隆号
D24L22

别名
Hepatocyte growth factor receptor; HGF receptor; HGF/SF receptor; Proto-oncogene c-Met; Scatter factor receptor (SF receptor); Tyrosine-protein kinase Met; MET

背景
磷酸化 Met (Tyr1349) 是指肝细胞生长因子受体 Met 的激活状态，Met 是一种二硫键连接的异二聚体受体酪氨酸激酶（~45 kDa 胞外 α 链和 ~145 kDa 跨膜 β 链），它与 HGF 结合，从而协调上皮细胞和其他细胞类型的侵袭性生长程序，如增殖、存活、迁移和形态发生。 Met蛋白的胞外区包含一个信号素（SEMA）结构域、PSI结构域和四个IPT重复序列，用于识别HGF并形成二聚体；其胞内区包含一个跨膜螺旋；胞内区包含一个近膜区（含有Tyr1003，用于CBL介导的泛素化/降解，以及抑制性Ser957/Ser975残基）、一个酪氨酸激酶结构域（含有激活环Tyr1234/Tyr1235，其磷酸化可增强催化活性）以及一个C端尾部，该尾部含有Tyr1349和Tyr1356残基，形成一个多底物结合位点。HGF结合后，Met蛋白二聚化，其激酶结构域对Tyr1234/Tyr1235进行反式磷酸化，从而稳定其活性构象，进而使Tyr1349（以及Tyr1356）发生磷酸化。磷酸化的Tyr1349为接头蛋白Gab1提供高亲和力结合位点，并募集包括GRB2、PI3K p85、SHP2、Src和STAT3在内的含SH2结构域的效应蛋白，从而构建一个信号枢纽，将Met与Ras-MAPK、PI3K-Akt、STAT和Rho家族GTP酶通路连接起来，驱动细胞周期进程、存活、迁移和上皮-间质转化。Tyr1349/Tyr1356的突变或缺失会损害Gab1的结合以及下游PI3K/MAPK的激活，尽管激酶活性得以保留。

背景

磷酸化 Met (Tyr1349) 是指肝细胞生长因子受体 Met 的激活状态，Met 是一种二硫键连接的异二聚体受体酪氨酸激酶（~45 kDa 胞外 α 链和 ~145 kDa 跨膜 β 链），它与 HGF 结合，从而协调上皮细胞和其他细胞类型的侵袭性生长程序，如增殖、存活、迁移和形态发生。 Met蛋白的胞外区包含一个信号素（SEMA）结构域、PSI结构域和四个IPT重复序列，用于识别HGF并形成二聚体；其胞内区包含一个跨膜螺旋；胞内区包含一个近膜区（含有Tyr1003，用于CBL介导的泛素化/降解，以及抑制性Ser957/Ser975残基）、一个酪氨酸激酶结构域（含有激活环Tyr1234/Tyr1235，其磷酸化可增强催化活性）以及一个C端尾部，该尾部含有Tyr1349和Tyr1356残基，形成一个多底物结合位点。HGF结合后，Met蛋白二聚化，其激酶结构域对Tyr1234/Tyr1235进行反式磷酸化，从而稳定其活性构象，进而使Tyr1349（以及Tyr1356）发生磷酸化。磷酸化的Tyr1349为接头蛋白Gab1提供高亲和力结合位点，并募集包括GRB2、PI3K p85、SHP2、Src和STAT3在内的含SH2结构域的效应蛋白，从而构建一个信号枢纽，将Met与Ras-MAPK、PI3K-Akt、STAT和Rho家族GTP酶通路连接起来，驱动细胞周期进程、存活、迁移和上皮-间质转化。Tyr1349/Tyr1356的突变或缺失会损害Gab1的结合以及下游PI3K/MAPK的激活，尽管激酶活性得以保留。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23778885/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19123972/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%