Phospho-PLCβ3 (Ser537) Antibody (Rabbit mAb) [K10E11]
目录号: F7351
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (Anisomycin, 25 ug/ml, 30 min), Lane 3: 293T (Anisomycin, 25 ug/ml, 15 min; λ phosphatase treated)
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议曝光 60s 以上。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
|
|---|
|
150 kDa
|
| 阳性对照 | HeLa cells (Anisomycin, 20 μg/ml, 15 min) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-PLCβ3 (Ser537) Antibody (Rabbit mAb) [K10E11] 仅识别 Ser537 处磷酸化的内源性 PLCβ3 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内膜系统，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q01970 |
| 克隆号 |
|---|
| K10E11 |
| 别名 |
|---|
| 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-3; phosphoinositide phospholipase C; Phosphoinositide phospholipase C-beta-3; phospholipase C beta 3; Phospholipase C-beta-3; phospholipase C, PLC beta 3; PLC-beta-3; PLCB3; SMDCD |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化 PLCβ3 (Ser537) 代表磷脂酰肌醇特异性 PLC 家族中磷脂酶 C β 3 的一个具有重要功能意义的调节状态，它将 G 蛋白偶联和受体酪氨酸激酶信号传导与磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸水解和下游钙-PKC 通路联系起来，PLCβ3 可催化肌醇 1,4,5-三磷酸和二酰甘油的生成，以响应包括 VEGF、凝血酶和其他 GPCR 激动剂在内的各种细胞外信号。 PLCβ3 具有一个 N 端 pleckstrin 同源结构域，其后依次为 EF-hand 结构域、紧密结合的 X-Y 催化核心（由一个短连接肽分隔）以及 C 端 C2 结构域。这些结构域共同协调膜结合、钙结合和底物结合，而 C 端调控区则整合来自 Gαq/11、Gβγ 和蛋白激酶的信号。Ser537 位于 PLCβ3 N 端半段，在 X 结构域上游，在内皮细胞中经 VEGFR2 刺激后迅速磷酸化，30 秒内即可检测到磷酸化，1 分钟内达到最大水平，同时抑制性 Ser1105 位点的磷酸化以及 PLCγ1 在 Tyr783 位点的酪氨酸磷酸化也同时发生。 VEGF激活VEGFR2可同时激活经典的PLCγ1和PLCβ3通路。VEGFR2选择性激酶抑制剂可消除VEGF诱导的PLCβ3在Ser537和Ser1105位点的磷酸化，表明Ser537修饰位于VEGF-VEGFR2受体酪氨酸激酶级联反应的下游，而非一般的GPCR信号通路。PLCβ3 Ser537磷酸化伴随催化性PIP2水解的增强，表现为VEGF刺激的内皮细胞中IP1/IP3生成增加。PLCβ3敲低可降低VEGF诱导的肌醇磷酸积累，表明PLCβ3与PLCγ1共同直接参与VEGF驱动的磷脂酰肌醇周转。 VEGF-VEGFR2-PLCβ3信号通路通过将PIP2水解和二酰甘油生成与小GTP酶CDC42的激活偶联，从而调控内皮细胞的定向迁移。PLCβ3的缺失会选择性地抑制CDC42的激活，而RhoA和Rac1的反应则不受影响。这与定向迁移的丧失、应力纤维形成减少以及血管生成过程中芽尖丝状伪足相关导向结构的减少相关。在胚状体血管生成模型中，VEGF刺激可诱导萌芽内皮细胞中PLCβ3的募集和磷酸化，磷酸化的PLCβ3定位于CD31阳性的血管结构，表明包括Ser537磷酸化部分在内的磷酸化PLCβ3在血管生成前沿信号传导和血管萌芽中发挥作用。 PLCβ3 是内皮细胞增殖的负调控因子，因为敲低 PLCβ3 会加速细胞周期进程，增加 S 期比例，提高细胞周期蛋白 D1 和 CDC2 的表达，而不会改变 VEGF 诱导的 ERK、JNK 或 p38 激活，这使得 Ser537 修饰的 PLCβ3 处于血管生成过程中平衡增殖与迁移的信号分支中。 PLCβ3 上的 Ser537 和 Ser1105 残基在 VEGF 和 GPCR 激动剂（如凝血酶和 PAR 配体）的作用下均发生磷酸化，这使得 Ser537 处于一个更广泛的磷酸化网络中，其中 PKA 或 PKC 对 Ser1105 的磷酸化抑制了 PLCβ3 的酶活性，而 CaMKII 对 Ser537 的磷酸化则有助于基础或刺激调节活性，因此磷酸化 PLCβ3 (Ser537) 可作为生长因子和 GPCR 通路中 Ca2+/CaMKII 连接的 PLCβ3 调节的读数。 VEGF–VEGFR2–PLCβ3 轴与 Gq/11 和 Gβγ 亚基相互作用，因为 VEGFR2 激活会激活内皮细胞中 PLCβ3 上游的 G 蛋白信号传导，而 PLCβ3 则在磷脂酰肌醇水解和 CDC42 依赖性细胞骨架重塑的水平上整合 RTK 和 GPCR 输入。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
