Phospho-Tau (Ser262+Thr263) Antibody (Rabbit mAb) [D14G14]
目录号: F2827
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: SH-SY5Y (Olcadaic acid and Calyculin A treated)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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79 kDa
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| 阳性对照 | SH-SY5Y cells (Olcadaic acid & Calyculin A treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | SH-SY5Y cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Phospho-Tau (Ser262+Thr263) Antibody (Rabbit mAb) [D14G14] 仅识别 Ser262 和 Thr263 处磷酸化的内源性 Tau 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，细胞质，细胞骨架，内膜系统，微管，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P10636 |
| 克隆号 |
|---|
| D14G14 |
| 别名 |
|---|
| MAPTL, MTBT1, TAU, MAPT, Microtubule-associated protein tau, Neurofibrillary tangle protein, Paired helical filament-tau, PHF-tau, MAPTL, MTBT1, TAU, MAPT, PHF-tau |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化tau蛋白（Ser262+Thr263）是指tau蛋白在其第一个微管结合重复序列的KXGS基序内发生磷酸化。该基序是一个调控热点，控制着tau蛋白与微管的亲和力、亚细胞分布以及其在tau蛋白病中参与病理性聚集的倾向。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其N端包含一个突出区域，该区域富含脯氨酸，含有多个丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序；C端包含一个重复序列，其中包含多个KXGS基序。Ser262和Thr263位于第一个重复序列中，这些残基的磷酸化会破坏稳定tau蛋白与微管结合的静电相互作用，并显著降低tau蛋白促进微管组装和稳定性的能力。靶向 KXGS 基序的激酶，包括 MARK 家族酶和相关的微管亲和力调节激酶，会产生磷酸化 Ser262 和磷酸化 Thr263 tau 蛋白，这些蛋白会从微管上脱离，增加可溶性 tau 蛋白的池，并促进 tau 蛋白重新分布到区室中，在那里 tau 蛋白可能会错误折叠并组装成寡聚体和原纤维，尤其是在其他表位（如 Thr212 和 Thr231）发生额外磷酸化时。磷酸化 tau Ser262 免疫反应性存在于胎儿 tau 蛋白和成人病变 tau 蛋白中，针对该表位的特异性抗体可检测到神经原纤维缠结、缠结前体、营养不良性神经突、神经毡丝以及阿尔茨海默病、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒病等疾病中的其他异常沉积物中的过度磷酸化 tau 蛋白，表明 Ser262 和邻近的 Thr263 区域的修饰是多种 tau 蛋白病变的共同特征，并且尤其在更严重的缠结中积累。对tau蛋白磷酸化模式的比较分析表明，Ser262位点的磷酸化在早期神经纤维缠结形成前体中的频率低于Ser199/202或Ser396/404等表位，但在细胞内和细胞外神经纤维缠结中则富集，这与该位点的磷酸化在破坏微管稳定性、促进神经纤维缠结成熟后期以及tau蛋白丝病理形成中的作用相一致。在实验模型中，Ser262位点的磷酸化也与Aβ相关的tau蛋白毒性有关。在Aβ42存在的情况下，Ser262修饰的tau蛋白表现出更高的毒性和聚集性，并促进神经元结构和功能的破坏，从而将这种修饰与淀粉样蛋白驱动的神经退行性级联反应联系起来。 |
| 参考文献 |
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