PME-1 Antibody (Mouse mAb) [L6L14]
目录号: F7126
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: K-562, Lane 2: Neuro-2A -
Immunofluorescent analysis of Hela cells using F7126 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:100
建议一抗稀释比: 1:100
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IF, IHC, FCM, ELISA |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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44 kDa
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| 阳性对照 | K-562 cells; SNU-16 cells; HEL 92.1.7 cells; Neuro-2A cells; EOC 20 cells; RIN-m5F cells; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| PME-1 Antibody (Mouse mAb) [L6L14] 可检测内源性 PME-1 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9Y570 |
| 克隆号 |
|---|
| L6L14 |
| 别名 |
|---|
| PPME1, Protein phosphatase methylesterase 1, EC:3.1.1.89, PME-1, PME1, PP2593, PRO0750 |
| 背景 |
|---|
| 蛋白磷酸酶甲基酯酶-1 (PME-1，又称PP2A甲基酯酶1) 是一种保守的丝氨酸水解酶，它通过逆转PP2A催化亚基C端甲基化并直接抑制磷酸酶活性位点，从而调控蛋白磷酸酶2A (PP2A)。PP2A是一种核心的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶复合物，控制着细胞生长、存活和应激信号传导。PME-1具有α/β水解酶折叠，其催化结构包含典型的丝氨酸水解酶的Ser-Asp-His三联体，以及N端低复杂度区域，该区域包含用于与PP2A全酶对接的短线性基序，其中包括模拟PP2A底物并与特定调控B亚基结合的基序。 PME-1通过水解催化亚基C端亮氨酸上的酯键，使PP2A去甲基化，从而去除与部分调节性B亚基有效结合所需的甲基，并改变PP2A全酶的组成和活性谱，进而改变MAPK/ERK和AKT等信号通路中的信号输出。PME-1还能直接结合组装好的PP2A核心和含有B56亚基的全酶，占据催化槽，并阻断磷酸底物的接近。因此，单个PME-1分子可以在同一复合物中既使催化尾部去甲基化，又抑制PP2A对结合底物的催化活性。 PME-1无序的N端区域与B56调节亚基上的多个远端位点相连，其中包括一个插入经典底物结合槽的底物模拟基序。同时，PME-1和全酶的大幅构象变化使PME-1催化核心定位，从而能够接近甲基化的PP2A尾部并抑制其活性位点。这种多方相互作用机制将全酶识别与甲基酯酶激活偶联起来。这些结合模式使PME-1能够对不同家族的PP2A全酶进行去甲基化，并广泛抑制PP2A全酶的功能。B56界面突变选择性地阻断PME-1对PP2A-B56复合物的活性，并改变特定比例的细胞PP2A的甲基化，包括参与p53信号通路的PP2A亚基。在胶质瘤和子宫内膜癌等癌症模型中，PME-1 过表达会降低 PP2A 肿瘤抑制活性，维持 ERK 和 AKT 通路信号传导，并支持恶性表型，包括增殖增加、侵袭和对激酶抑制剂的耐药性，并且在临床肿瘤标本中 PME-1 水平升高，与疾病进展相关。 |
| 参考文献 |
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