pro Caspase3 Antibody (Rabbit mAb) [D14C8]
目录号: F5469
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Jurkat, Lane 2: Jurkat (Camptothecin treated)
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:10000
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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32 kDa
35 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | HAP1 cells; Jurkat cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HAP1 cells (Staurosporine, 1μM, 4 h); Jurkat cells (Camptothecin treated) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| pro Caspase3 Antibody (Rabbit mAb) [D14C8] 可检测内源性 pro Caspase3 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| P42574 |
| 克隆号 |
|---|
| D14C8 |
| 别名 |
|---|
| CPP32, CASP3, Caspase-3, CASP-3, Apopain, Cysteine protease CPP32, Protein Yama, SREBP cleavage activity 1, CPP-32, SCA-1 |
| 背景 |
|---|
| 前体caspase-3是caspase-3的无活性酶原前体，caspase-3是一种执行caspase，在细胞中以组成型二聚体的形式存在，由一个N端前结构域连接到一个大亚基和一个较小的C端亚基，两者通过亚基间连接子连接。激活需要该连接子的蛋白水解切割，而不是在没有切割的情况下发生的任何构象变化。这种切割是由上游起始caspase完成的，主要是caspase-9，它在凋亡体中发挥作用。凋亡体是一个七聚体平台，当细胞色素c和dATP在胞质溶胶中与Apaf-1结合时组装而成，每个Apaf-1亚基通过各自的CARD结构域与一个前体caspase-9亚基非共价偶联；被募集到该平台的 caspase-9 特异性地在 172IETD-S 位点切割 procaspase-3，而这种 ISL 切割事件是生成具有催化活性的 caspase-3 所必需的。caspase-3 的完全成熟还需要去除其 N 端前结构域，这一过程通过两次连续的切割事件完成：首先在 Asp9 位点快速切割，随后在 Asp28 位点进行较慢的切割。仅 Asp9 位点的突变就足以阻断前结构域的去除和下游 caspase 的激活。而表达经基因工程改造以完全缺失前结构域的 caspase-3 的细胞，虽然不会持续激活，但却更容易受到死亡信号的刺激。这表明前结构域抑制 caspase-3 的激活，但并非其在去除后维持激活的必要条件。一旦被激活，caspase-3 对其自身的激活因子发挥直接的反馈作用：caspase-3 在不同的位点 Asp330 切割 procaspase-9，生成较小的 p10 亚基，该亚基去除 p12 片段的 15 个 N 端氨基酸，包括 XIAP BIR3 结合基序。与仅在 caspase-9 的主要加工位点进行切割相比，这种 Asp330 切割使凋亡体驱动的 caspase-3 激活增加高达八倍。而无法在 Asp330 处被切割的点突变体则表现出凋亡体介导的 caspase-3 活性的几乎完全丧失，这表明 caspase-3 到 caspase-9 的放大环是凋亡体整体催化输出的一个明确组成部分，而不是 caspase-9 激活的被动下游结果。 Asp330 的切割事件暴露了生成的 p10 片段上的一个新的 N 端肽序列，该序列保留了被 XIAP 抑制的能力，从而将 caspase-3 反馈切割步骤直接与 caspase-9 水平上而不是 caspase-3 本身上运作的明确的细胞凋亡制动机制联系起来。 |
| 参考文献 |
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