RALA Antibody (Rabbit mAb) [G17M6]
目录号: F5011
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A172, Lane 2: COS-7, Lane 3: Neuro-2a
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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24 kDa
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| 阳性对照 | A172 cells; COS-7 cells; Neuro-2A cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| RALA Antibody (Rabbit mAb) [G17M6] 可检测内源性 RALA 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| P11233 |
| 克隆号 |
|---|
| G17M6 |
| 别名 |
|---|
| Ras-related protein Ral-A, RALA, RAL |
| 背景 |
|---|
| RalA是一种Ras相关的小GTP酶，它在GDP结合态和GTP结合态之间循环，并作为Ras和RalGEF下游的膜相关分子开关，调控胞吐复合体依赖的囊泡运输、胞质分裂以及支持多种肿瘤类型增殖、存活和转移的致癌信号通路。该蛋白具有Ras超家族成员特有的保守GTP结合P环、开关I/II区以及C端高变区，并含有脂化基序。这些结构将RalA锚定到特定的膜微区，并允许其以GTP依赖的方式与效应分子（如胞吐复合体组分Sec5和Exo84、RalBP1/RLIP76以及磷脂酶D1）结合，从而将核苷酸状态与胞吐、胞吞和肌动蛋白细胞骨架调控相偶联。在经典的Ras信号通路中，活化的Ras结合并激活RalGEF（RalGDS、RGL1-3），后者进而将GTP加载到RalA上；组成型活化的RalA表达增强致癌Ras和Raf的转化活性，而显性失活的RalA则抑制Ras和Raf驱动的转化，这表明Ras-RalGEF-RalA通路与Raf-MEK-ERK通路平行运作，共同增强致癌活性。RalA的激活促进胞吐复合体在质膜和中心体的组装，调节货物囊泡的极性运输，并有助于胞质分裂的顺利完成；此外，RalA依赖的胞吐复合体信号传导还影响受体循环和整合素转运，这为RalA调控细胞黏附、迁移和侵袭提供了一种机制途径。人类癌症模型中的遗传学和功能研究表明，RalA是Ras诱导肿瘤发生的必要条件：在Ras突变癌细胞中敲低或抑制RalA会损害其锚定非依赖性生长、肿瘤形成和已建立的异种移植瘤的维持，而RalB的缺失则对细胞存活和自噬产生更显著的影响，这凸显了不同亚型对致癌Ras网络的特异性贡献。在三阴性乳腺癌中，RalA活性升高与侵袭性临床行为相关，而RalA的实验性沉默可减少原发肿瘤生长、限制转移性定植并降低癌症干细胞样特性，这表明RalA是该亚型进展和转移的关键驱动因素，也是亚型选择性抑制的理想靶点。 |
| 参考文献 |
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