RCC1 Antibody (Rabbit mAb) [J20J20]
目录号: F9725
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela, Lane 2: A431, Lane 3: Jurkat, Lane 4: 293T
操作要点
WB
建议一抗稀释比: 1:10000
建议一抗稀释比: 1:10000
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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45 kDa
48 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human tonsil tissue; Human pancreas tissue; HeLa cells; A431 cells; Jurkat cells; 293T cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| RCC1 Antibody (Rabbit mAb) [J20J20] 可检测内源性 RCC1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 染色体，细胞质，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P18754 |
| 克隆号 |
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| J20J20 |
| 别名 |
|---|
| CHC1, RCC1, Regulator of chromosome condensation, Cell cycle regulatory protein, Chromosome condensation protein 1 |
| 背景 |
|---|
| RCC1（染色体凝聚调节因子1）是Ran GTP酶的经典鸟嘌呤核苷酸交换因子，也是一种染色质结合支架蛋白，它在核膜和有丝分裂染色体上建立RanGTP梯度，从而协调核质运输、核膜动态变化以及纺锤体组装与细胞周期进程。该蛋白具有七叶β螺旋桨折叠结构，可直接结合核小体和双链DNA。这种染色质结合使RCC1-Ran复合物在染色体上富集，从而使Ran上的GDP-GTP交换产生高浓度的局部RanGTP。同时，胞质中的RanGAP和RanBP1促进RanGDP的形成，共同构成一个空间极化的Ran系统，该系统控制着核内输入蛋白的货物释放，并促进染色质附近纺锤体和核膜组分的组装。在细胞间期，RCC1驱动的核内RanGTP维持着经典的依赖于输入蛋白β的蛋白质输入以及输出蛋白介导的RNA和蛋白质输出的方向性。RCC1水平或活性的扰动会破坏这种运输，导致关键调控因子定位异常，并造成G1/S期转换和有丝分裂起始缺陷。在有丝分裂期，RCC1产生的染色体相关高浓度RanGTP通过从输入蛋白复合物中释放TPX2和NuMA等纺锤体组装因子来激活它们，促进着丝粒-微管的正确连接，并支持中期-后期转换的及时进行；RCC1还以多种方式参与着丝粒内部的组成和着丝粒的调控，包括在中期-后期转换时以Ran非依赖的方式置换Shugoshin-1和染色体乘客复合物。 RCC1 经常过表达，并发挥肿瘤促进因子的作用：整合泛癌分析表明，高水平的 RCC1 与细胞周期基因特征、增殖指数升高、免疫抑制性肿瘤微环境特征以及不良预后相关；在透明细胞肾细胞癌中的功能研究表明，RCC1 支持 G1/S 期进程、抑制细胞凋亡并稳定 EZH2 蛋白，因此敲低 RCC1 会降低细胞增殖、增加凋亡标志物并促进 EZH2 降解。在乳腺癌和肺癌模型中靶向沉默 RCC1 也会降低细胞活力、克隆形成和迁移能力，增加细胞凋亡，并下调 DNA 复制和修复相关通路，这凸显了 RCC1 在维持致癌细胞存活和细胞周期程序中更广泛的作用。RCC1 还作为一种致癌驱动因子，维持细胞质中 Skp2 的水平并降低 p27Kip1 的水平。 RCC1的缺失会破坏Skp2的核质转运和稳定性，导致p27积累和G1期阻滞，这进一步表明RCC1的Ran依赖性转运功能与肿瘤细胞中泛素连接酶活性和CDK调控密切相关。在神经系统中，新发现的RCC1双等位基因错义突变会导致儿童发生常染色体隐性遗传的急性轴突神经病。突变型RCC1蛋白的GDP-GTP交换活性降低，热稳定性下降，且患者成纤维细胞表现出应激诱导的Ran核定位和核质转运缺陷。这些结果表明，完整的RCC1-Ran信号通路对于维持轴突完整性至关重要，而RCC1功能障碍可能是导致严重感染诱发性神经退行性变（临床表现类似于格林-巴利综合征）的潜在原因。 |
| 参考文献 |
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