Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC)

1.蛋白质制备
1) 为了获得最佳标记效果，请配制蛋白（抗体）浓度为2 mg/mL。
2) 蛋白质溶液的pH值为8.5±0.5。 pH值低于8.0时，用1m碳酸氢钠调节。
3）如果蛋白浓度低于2mg/ml，标记效率会大大降低。 为了获得最佳的标记效率，建议最终蛋白浓度范围为2-10 mg/mL。
4) 蛋白缓冲液中必须不含伯胺（如Tris或甘氨酸）和铵离子，否则会影响标记效率。
2.染料制备
将无水 DMSO 添加到 FITC 瓶中，制成 10 mM 储备溶液。 通过移液或涡旋充分混合。
3.染料用量的计算
反应所需FITC的量取决于待标记蛋白的量，FITC与蛋白的最佳摩尔比约为10。
示例：假设所需标记蛋白为 1 mL 2 mg/mL IgG（MW=150,000），用 1 mL DMSO 溶解 1 mg FITC，则所需 FITC 体积为 40 μL。
4.进行缀合反应
1) 将大量新鲜制备的 10 mg/mL FITC 缓慢添加到 0.5 mL 蛋白质样品中。 在溶液中，轻轻摇动混合，然后短暂离心，将样品收集在反应管底部。 请勿充分混匀，以免蛋白质样品变性、失活。
2）将反应管置于暗处，室温下轻轻孵育，间隔60分钟。10-15分钟，轻轻翻转反应管数次，使两种反应物充分混合，提高棒效。
5.纯化结合体
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。
1) 根据生产说明书准备Sephadex G-25柱。
2) 将反应混合物（来自“运行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。
3) 当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。
合并含有所需染料-蛋白质缀合物的级分。