EPZ004777

EPZ004777在DMSO中连续稀释3倍，起始浓度为1 mM，形成全部10种浓度。1 μL 等份的每种抑制剂稀释液接种到384孔微量滴定板中。100％抑制对照包括2.5 mM 终浓度的产品抑制剂S-adenosyl-L-homocysteine(SAH)。化合物与每孔40 ml 0.25 nM DOT1L(1-416) 在实验缓冲液(20 mM TRIS [pH 8.0] 10 mM NaCl, 0.002% Tween 20, 0.005% Bovine Skin Gelatin, 100 mM KCl, 和 0.5 mM DTT)中温育30分钟。每孔加入10 ml 底物开始反应，底物包括实验缓冲液（含200 nM ³H-SAM(80 Ci/mmol), 600 nM 未标记的SAM）和 20 nM 核小体 (终反应混合物中的底物都处于其各自K_m值)。反应在室温下进行120分钟，然后每孔使用10 ml 800 mM SAM淬火。测量渗透进核小体的放射性。在类似的平衡试验条件下，使用处于其各自K_m值的SAM和蛋白质/肽底物，测量一组组蛋白甲基转移酶的IC50值 。

测评人类细胞系增殖和活力，呈指数生长的细胞接种按一式三份接种在96孔板中，终体积为150 ml。在3 μM (增殖曲线), 或浓度不断增加(测定IC50) EPZ004777（高达50 μM）时，进行细胞温育。每隔3-4天，通过Guava Viacount实验测定活存细胞，最多至18天，然后使用Guava EasyCyte Plus 仪器分析。进行细胞计数时，更换生长培养基和EPZ004777，细胞分裂回每孔5×10⁴。总细胞数表现为每孔分裂调整后的活细胞。根据浓度依赖性曲线每个时间点，使用Graphpad Prism 软件，测定每种细胞系的IC50值。测定IC50值直到IC50值稳定（THP-1细胞需18天，所有其它细胞系需14天）。测评EPZ004777对转化的小鼠造血祖细胞的作用效果，两个独立转导各自病毒的细胞按每孔0.5-1×10⁵个细胞接种在24孔板，孔中含1 ml 培养基，然后使用浓度高达30 mM EPZ004777处理。进行细胞计数，每隔3-4天，在含新鲜化合物的新鲜培养基中再接种等量细胞数。MTT法检测中，第10天，收获成排再接种的细胞，然后按每孔 2×10⁴各细胞一式三份接种在含适当浓度EPZ004777的100 ml培养基中。细胞温育2.5天，然后使用10 ml MTT试剂处理3小时，在100 ml MTT-增溶缓冲液 (来自Cell Proliferation Kit I [MTT])中裂解过夜。